研究背景
AraliacordataThunb，是属于五加科（Araliaceae）的多年生草本植物，主要分布在东亚，大多在韩国，日本和中国。之前的植物化学研究表明其含有精油，聚乙炔，三萜和二萜类化合物，其中的ent-pimarane和ent-kaurane型二萜类化合物被认为是其主要成分。这些化合物具有广泛的药理作用，包括抗炎，平喘，胆碱酯酶和BACE1抑制活性等。
研究结果
以生物活性为介导从Araliacordata甲醇提取物中分离出四种新的ent-pimarane二萜类化合物（1-4）和一个diacetylene（5）以及21种已知化合物（6-26，图1）。它们的结构是基于一维和二维NMR和HRESIMS数据而建立。通过电子圆二色性数据分析，单晶X射线衍射和Mosher酯化方法确定新化合物的绝对构型。
获得化合物1，为白色无定形粉末。通过HRESIMS数据（m/z.[M+Na]+；计算值.）结合13CNMR数据（表1）推导出其分子式为C20H30O3。1的1H和13CNMR谱类似于ent-pimara-8（14），15-dien-19-oicacid（6），除了缺乏乙烯基的质子信号（这是pimarane型二萜类化合物的特征）。取而代之的是，1HNMR谱中存在δH2.78（dd，J=4.1,2.9Hz），2.56（dd，J=4.9,4.1Hz），2.50（dd，J=4.9,2.9Hz）的ABX质子出现在1的1HNMR谱中，这表明存在末端环氧乙烷环。在HMBC谱中，δH5.05（H-14）处的烯烃质子与C-7，C-12，C-15和C-17的相关性，证实了Δ8（14）双键位置。H-15（δH2.78）和C-12（δC34.2），C-13（δC34.3），C-14（δC.9）和C-17（δC24.9）之间以及H2-16（δH2.56,2.50）和C-13（δC34.3）和C-15（δC58.9）之间的HMBC相关性表明环氧乙烷部分在C-13处的连接（图1）。H-11α/H-15与Me-20，H-5/H-9和Me-18以及H-9/Me-17的NOESY相关性显示Me-17和Me-18是β取向的，而Me-20是α取向的（图1）。通过Me-17/H-14，H-15和H-16β，H-15/H-14，H-11α和Me-20的NOE相关性解释C-15的相对构型。因此，C-15的构型被指定为15S*（图1）。但是，仅通过NOESY相关性定义C-15配置是有风险的。因此，使用CuKα辐射[Flack参数=0.06（3）和Hooft参数=0.07（3）]的单晶X射线衍射分析证实了上述二维结构并确立了1的绝对构型（4R，5S，9R，10S，13S，15S）（图2）。通过比较实验和计算的电子圆二色性（图3）。因此，aracordatinA（1）的结构确定为（4R，5S，9R，10S，13S，15S），epoxy-ent-pimar-8(14)-en-19-oicacid。
图1化合物1-26以及化合物1关键HMBC和NOESY相关性
图2化合物1的X射线ORTEP渲染分子结构
图3化合物1的实验和计算的ECD光谱表1化合物1和2在CDCl3中的1HNMR和13CNMR数据
获得化合物2，为白色无定形粉末。其分子式由13CNMR（表1）和HRESIMS数据（m/z.[M+H]+；计算值.）确定为C20H28O3，不饱和度为7。除了双键的位置，1H和13CNMR数据（表1）与melanocaneE（12）相似。从H-11（δH5.91）到C-8（δC30.2），C-10（δC39.8）和C-13（δC46.5），从Me-20（δH1.09）到C-1（δC40.4），C-5（δC46.6），C-9（δC.2）和C-10（δC39.8）的HMBC相关性表示Δ9（11）双键的位置。C-14位置的羰基通过从H-15（δH6.19）到C-14（δC.1），Me-17（δC21.6）和C-12（δC41.4），和从Me-17（δH1.20）到C-14（δC.1）的HMBC相关性确定（图4）。通过NOESY光谱确定2的相对构型，其中H-5/H-8，H-5/Me-18和H-8/Me-17的交叉峰证实了它们的β取向（图4））。2的绝对构型由其实验ECD光谱中nm（Δε+0.85），nm（Δε+9.80）的正Cotton效应和nm（Δε-19.30）的负Cotton效应确定，其与计算的ECD光谱匹配良好（。因此，aracordatinB（2）的结构定义为（4R，5S，8R，10R，13R）-14-oxo-ent-pimar-9(11),15-dien-19-oicacid。
图4化合物2的关键HMBC和NOESY相关性
分离化合物3，为白色无定形粉末。其分子式C25H38O4由13CNMR（表2）和HRESIMS数据（m/z.[M-H]-；计算值.）确定，表明含有7个不饱和度。1H和13CNMR数据（表2）与ent-pimara-8（14），15-dien-19-oicacid（木酸）（6），相似，除了存在17-氧亚甲基[δH4.01（d，J=10.6Hz，H-17b），3.74（d，J=10.6Hz，H-17a）；δC71.2]，以及异戊酰基[δH2.19（C-2），2.08（C-3），0.95（C-4），和0.94（C-5）；δC.3（C-1），43.6（C-2），25.7（C-3），22.5（C-4），22.4（C-5）]。从烯烃H-14（δH5.24）到C-13（δC42.8），C-15（δC.3）和C-17（δC71.2）和从H2-17（δH4.01,3.74）到羧基碳C-1（δC.3）表明异戊酰基位于C-17（图5）。H-5/H-9和Me-18，H-9/H-12β，H-12β/H-17，Me-20/H-11α和H-11α/H-15的NOE交叉峰表明C-17异戊酰基的β取向（图5）。通过比较实验和计算的ECD光谱，将3的绝对构型确定为（4R，5S，9R，10S，13S）。因此，aracordatinC（3）的结构定义为（4R，5S，9R，10S，13S）-17-isovaleroyloxy-ent-pimar-8(14),15-dien-19-oicacid。
图5化合物3的关键HMBC和NOESY相关性
表2化合物3和4在CDCl3中的1HNMR和13CNMR数据
化合物4，一种白色无定形粉末，得到由HRESIMS（m/z.[M-H]-；计算值.）和13CNMR数据（表2）推导出分子式为C25H40O5。结合2DNMR（COSY，HMQC，HMBC和NOESY）数据解释1H和13CNMR数据，表明4具有与dumetoraneB相同的2D结构，dumetoraneB是从A.dumetorum的根中分离得到。然而，它的绝对配置以前没有确定。δC76.4（C-15）处的特征化学位移指示（15R）-构型，而以（15S）形式天然存在的ent-pimar-8(14)-en-15,16-diols中的化学位移会在δC79.0（C-15）。修改后的Mosher的ester程序与ECD数据的比较相结合，用于定义4的绝对构型。用（+）-和（-）-α-甲氧基-α-（三氟甲基）苯基乙酰氯（MTPA-Cl）处理化合物4，分别得到（R）-和（S）-MTPA酯（4r和4s）。MTPA酯（ΔδS-R）之间的1HNMR化学位移差异表明（15R）-构型（图7）。计算出的4的ECD谱与实验结果吻合良好，进一步支持绝对构型。因此，aracordatinD（4）的结构被确定为（4S，5S，9R，10S，13S，15R）-15-hydroxy-16-isovaleroyloxy-ent-pimar-8(14)-en-18-oicacid.
图6化合物4的关键HMBC和NOESY相关性
图7化合物4的MTPA酯的δS-δR值
分离化合物5，为棕色油状物。通过HRESIMS（m/z.[M+Na]+；计算值.6）和13CNMR数据（表3）推导出分子式为C26H30O4，表明不饱和度为14。红外吸收显示羟基（cm-1）、乙炔（，cm-1）、酯羰基（cm-1）、烯烃（cm-1）和芳香族（，cm-1）官能团。在，，和nm处的UV吸收表明存在二乙炔和共轭苯基部分。1HNMR数据（表3）显示两个（Z）-烯烃质子在δH5.63（dd，J=10.7，7.6Hz，H-10）和5.53（dd，J=10.7，9.6Hz，H-9）的信号，一个末端乙烯基在δH5.81（ddt，J=17.2，10.5，6.9Hz，H-16），5.01（brd，J=17.2Hz，H-17a）和4.95（brd，J=10.5Hz，H-17b），两个氧甲基质子在δH5.49（t，J=6.5Hz，H-3）和5.20（d，J=8.3Hz，H-8），δH1.06的末端甲基（t，J=7.4hz，H-1），以及δH1.23~2.11的12个亚甲基质子。13CNMR和HSQC实验表明在δC79.2,78.3,69.3和68.9处有四个非质子化炔烃，在δC.5和.7处有两个烯烃，在δC.0和.3处有一个末端乙烯基，两个含氧碳在δC65.2和58.6，甲基在δC9.4，还有六个亚甲基碳。芳香区域中剩余的1H和13CNMR数据与反式对香豆酰基的存在一致[δH7.68（d，J=16.0Hz，H-3），6.31（d，J=16.0Hz，H-2），7.45（d，J=8.2Hz，H-5，9）和6.86（d，J=8.2Hz，H-6，8）；δC.1（C-1），.7（C-2），.5（C-3），.1（C-4），.1（C-5，C-9），.9（C-6，C-8），.8（C-7）]。H-3（δH5.49），H-2（δH6.31），H-3（δH7.68）与C-1（δC.1）羧基碳的HMBC相关性表明反式对香豆酰基与C-3连接（图8）。两个烯烃质子（H-9和H-10）的Z构型由10.7Hz的小耦合常数以及H-9和H-10的强NOESY相关性确定（图8）。绝对构型由改进的Mosher方法推导，MTPA酯（ΔδS-R）之间的1HNMR化学位移差异证实了（8S）-构型（图9）。然而，由于基于实验和计算的ECD数据比较模糊，未确定C-3的绝对构型。因此，aracordatylene（5）的结构定义为8S,Z)-8-hydroxyheptadeca-9,16-dien-4,6-diyn-3-yl(E)-3-(4-hydroxyphenyl)acrylate
图8化合物5的关键HMBC和NOESY相关性
图9化合物5的MTPA酯的δS-δR（Hz）值
表3化合物5在CDCl3中的1HNMR和13CNMR数据
使用Griess试剂评估所有化合物对RAW.7巨噬细胞中LPS诱导的NO产生的抑制作用。氨基胍用作阳性对照（IC50=18.7μM）（表4）。使用MTT测定评估细胞活力，表明没有一种测试化合物在其有效浓度下显示出任何显着的细胞毒性以抑制NO产生。与ent-pimarane二萜类化合物的抑制作用相比，化合物2,3,6-9,11-14（IC50值：10.0-26.0M）的抑制作用明显强于化合物1和4（IC50值：69.4和35.1M），唯一的区别是Δ15（16）双键氧化成环氧化物或氧亚甲基官能团，表明C-13乙烯基的存在似乎对NO抑制至关重要。然而，化合物10和15显示弱抑制作用（IC50值分别为66.8和47.2μM），表明C-7处的β-羟基或羰基可能是活性丧失的原因。比较四种ent-kaurane二萜类化合物16-19和21（IC50值分别为5.4,14.2,47.8,28.2和51.1μM）的抑制作用表明，C-16官能团对NO的影响抑制作用似乎是外亚甲基甲酰基≥羟甲基或羟基羰基的顺序。然而，发现具有C-15羟基的化合物20（IC50值：25.4μM）具有弱抑制作用。二乙炔衍生物5,23-26在1.1-40.5μM范围内显示出对NO产生的抑制作用，并且有趣的是，化合物5（其是在C-3处具有反式对香豆酰基的dehydrofalcarindiol衍生物）显示出显着的抑制作用（IC50值：1.1μM）。最近，发现几种二萜类化合物如pimarane，ent-pimarane和ent-kaurane骨架对NO产生具有抑制作用。A.cordata根中的ent-Pimara-8(14),15-dien-19-oicacid(continentalicacid)(6)and7α-hydroxy-ent-pimara-8(14),15-dien-19-oicacid(14)对COX-1和COX-2酶具有抑制活性。此外，来自Acanthopanaxgracilistylus的ent-pimarane和ent-kaurane二萜类化合物，包括7-oxo-ent-Pimara-8（14），15-dien-19-oicacid（10）对LPS诱导的炎性细胞因子如IL-1β，IL-8和TNF-α的产生具有抑制作用。
表4化合物1-26对LPS诱导的巨噬细胞RAW.7细胞NO产生的抑制作用
本文于年2月26日在线发布于JournalofNaturalProducts，第一作者为JunGuKim，通讯作者为BangYeonHwang，通讯
本文编辑：佚名
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